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微流控技术的应用前景_微流控芯片的前景如何？( 二 )


一般来说 ， 文库制备的核心步骤包括：1）片段化及或选出特定长度的片段 ， 2）将其转化为双链的形式 ， 3）将寡核苷酸接头连接至片段末尾以及4）对文库进行定量；目标DNA片段的大小是NGS文库构建的关键因素 。对核酸进行片段化的方法主要包括物理、酶切和化学的方法 。物理方法包括声波剪切（代表：Covaris）和超声（代表：BioRuptor） ， 酶切方法包括非特异性内切酶和转座酶片段化；我们实验室中 ， Covaris, Woburn, MA主要用于获得100-5000bp范围的DNA片段 ， 而Covaris g-TUBEs主要用于mate-pair文库所必需的6-20kb范围的DNA片段 。酶切的方法包括DNase I或片段化酶的消化 ， 一个两种酶的混合（New England Biolabs, Ipswich MA） 。两种方法都很有效 。但是 ， 片段化酶相比物理方法会产生更多的假indel 。另一种酶切方法是Illumina的Nextera ， 利用转座酶进行随机片段化并把接头序列插入双链DNA中 。这种方法有几个优势 ， 包括 ， 减少样品处理和制备的时间 。
文库大小是由插入片段（指的是接头序列之间的文库部分）大小决定的 ， 因为接头序列的长度是不变的 。反过来说 ， 最佳插入片段长度是有NGS设备以及特定测序应用决定的 。比如 ，  illumina中 ， 最佳片段大小是受簇生成过程影响的 ， 这个过程包括 ， 文库编写、稀释以及分布至芯片表面进行扩增 。虽然 ， 短片段扩增更加有效 ， 长片段文库能够产生更大、更弥散的簇 。我们用illumina测序的文库最大为1500bp 。
最佳文库大小也是由测序应用决定的 。对于外显子测序来说 ， 80%以上的人类外显子长度小于200bp 。我们测试PE100bp ， 外显子文库大小约为250bp ， 这样可以匹配大多数外显子的平均大小 ， 结果中没有重叠的读对 。RNA-seq文库大小也是由应用决定的 。对于基因表达分析我们采用SE100的测序 。但是对于 ， 可变剪切或转录起始终止位点的判定 ， 我们选择PE100的方案 。大多数应用中 ， RNA在片段化之前会逆转录成cDNA的形式 。一般是利用二价金属离子（镁或锌）对RNA进行可控的热消化 。文库片段大小可以通过调节消化反应的时间来控制 ， 重复性很好 。
在最近对7个RNA-seq文库制备方法的研究中 ， 大多是先对RNA进行片段化然后进行加接头 。有两种方法 ， 不利用随机引物 ， 或者说在SMARTer Ultra Low RNA试剂盒中 ，  合成具有固定3' ， 5'序列的全长cDNA序列 。全长的cDNA文库（平均2kb）可以通过长距离PCR（LD-PCR）进行扩增 。这种扩增的双链cDNA再通过声波剪切至合适的长度 ， 用在标准的illumina文库准备过程中（包括 ， 末端修复和补平 ， 加A和接头连接 ， 再通过PCR进行扩增 。）
另一种文库构建后对文库大小处理步骤是片选以及去除接头二聚体或其他文库制备的副产物 。接头二聚体是接头自连的结果 。这些二聚体成簇效率非常高 ， 而且会消耗掉珍贵的芯片空间 ， 但不产出任何有效数据 。因此 ， 我们通常利用磁珠法或切胶回收 。磁珠法适用于起始材料比较充足的情况 。若样本投入有限 ， 就会生成更多的接头二聚体 。我们的经验是 ， 磁珠为基础的方法在这种情况下不适用 ， 需要结合磁珠和切胶回收的方法 。
在microRNA/small RNA文库制备过程中 ， 目的产物通常只比120bp的接头二聚体长20-30bp 。因此 ， 必须使用切胶回收的方法获得尽可能多的目的序列 。这种分离精度对于磁珠来说就不适用 。另外 ， 我们经常需要建大插入片段（1kb）的文库 ， 结合更长的读长PE300以及无PCR步骤 ， 用于细菌基因组的从头组装 。为了尽可能获得可用于组装的数据 ， 就必须要小心地进行切胶回收以获得大小较为一致的插入片段 。
在利用DNA样本进行文库构建过程中有几个考虑 ， 包括起始材料的量以及该文库是用于重测序（有可用于比对的参考序列）还是从头测序（需要利用此次下机数据组装出新的参考序列） 。文库制备容易存在bias ， 这是由于基因组存在高GC或低GC的区域 ， 目前已经开发了解决这些问题的方法 ， 包括仔细选择用于扩增的聚合酶、循环数、条件以及缓冲液等 。


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