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微流控技术的应用前景_微流控芯片的前景如何？( 三 )


DNA样本的文库制备 ， 不管是用于WGS、WES、ChIP-seq还是PCR扩增子 ， 一般都遵循相同的流程 。总的来说 ， 对于任何应用 ， 目标都是使文库尽可能的复杂 。
DNA建库试剂盒目前有多个品牌 。竞争也促使价格迅速下降以及质量的提升 。这些试剂盒能够处理DNA起始量从ug到pg多个级别 。但是 ， 我们需要记住一点 ， 起始量大可以降低扩增循环数 ， 因此文库复杂度更高 。除Nextera外 ， 文库制备步骤通常包括：1）片段化 ， 2）末端修复 ， 3）5端磷酸化 ， 4）3端加A ， 5）接头连接 ， 6）几个cycle的PCR以富集加了接头的产物 。Ion Torrent流程的主要不同在于平末端连接不同的接头序列 。
起始DNA被片段化后 ， 会使用3个酶的混合物（ T4 多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶以及 Klenow大片段 ）进行末端补平和5端磷酸化 。3端加A尾利用Taq聚合酶或Klenow片段（exo-） 。Taq在加A尾上更有效率 ， 但Klenow在不能用加热方法时 ， 比如mate-pair文库可以适用 。在接头连接过程中 ， 最适的接头：片段比例大约为10：1 ， 以摩尔数为单位 。接头太多会形成难以分离的二聚体 ， 这些二聚体在随后的扩增中会占主导地位 。末端修复和加A反应后 ， 磁珠或胶回收的方法都适用 ， 但连接反应后我们发现 ， 磁珠的方法能够更有效地去除接头二聚体 。
为了便于多样本混合 ， 可以对不同样本使用不同barcode的接头 。另外barcode也可以由PCR扩增过程经不同barcode的引物加入 。可以从多个供货商购买高质量的带barcode的接头和PCR引物 。目前DNA文库构建的所有组分 ， 从接头到酶 ， 都有详细的文字说明 ， 可以组装成自制的文库制备试剂盒 。
另一种方法是Nextera方法 ， 利用转座酶对DNA进行随机打断 ， 并在一个单管中对其加标签（又称tagmentation） 。这种工程化的酶有两个功能 ， 对DNA进行片段化 ， 并将特定的接头加到片段化DNA的两端 。这些接头序列在接下来的PCR过程中用于扩增插入片段 。PCR反应会加入barcode 。这个制备过程相对传统方法的优势在于 ， 将片段化、末端修复和接头连接合并成一步 。这种方法相对于机械片段化的方法来说 ， 对DNA的起始量更加敏感 。为了实现在合适的距离进行片段化 ， 转座酶相对样本的比例非常关键 。因为片段大小依赖于反应效率 ， 所有反应的参数 ， 比如 ， 温度和反应时间 ， 都非常关键 ， 需要严格控制 。
一些课题组发表了对单个细胞基因组进行测序的结果 。现在的策略采用多重链置换（MDA）对整个基因组进行扩增 。MDA主要是利用了随机引物和phi29 ， 一种高度进行性的链置换聚合酶 。虽然这个技术能够产生足够的量用于测序文库的构建  ， 但它的一个问题在于非线性扩增造成的大量的bias 。最近有研究认为通过加入一个半线性的预扩增步骤能够减少bias 。Fluidgm基于单细胞分离和微流控技术用于单细胞文库制备 ， 每次运行可获得最多96个单细胞 。
对于RNA文库 ， 我们需要根据测序目的来进行文库构建方案的筛选 。如果目的是发现复杂全面的转录事件 ， 文库需要覆盖整个转录组 ， 包括 ， 编码、非编码、反义以及基因间RNA ， 而且需要尽可能的完整 。但是 ， 很多场合 ， 目的只是研究能够翻译成蛋白质的编码mRNA的转录本 。另一种情况只涉及small RNA ， 大多miRNA ， 也包括snoRNA ， piRNA ， snRNA以及tRNA 。虽然 ， 我们想要详述RNA测序文库的原则 ， 但无法一一列举 。感兴趣的读者可以自行研究 。
NGS应用到RNA-seq最初成功的例子之一是 miRNA。制备miRNA测序文库非常简单 ， 通常是一步反应 。事实上 ， miRNA在5端有天然磷酸修饰 ， 这允许连接酶选择性地靶向miRNA 。
illumina步骤的第一步 ， 3端阻断 ， 5端腺苷化的DNA接头通过截断的T4 RNA连接酶2被连接至RNA样本 。这个酶经过修饰 ， 能够对3端接头底物进行腺苷化 。结果是 ， 其他RNA片段在这个反应中不会连接在一起 。只有腺苷化的寡核苷酸可以连接到游离的RNA的3端末端 。由于接头3端是阻断的 ， 无法进行自连 。下一步 ， 在ATP和RNA连接酶1的作用下加入5端RNA接头 。只有5端磷酸化的RNA分子能够在连接反应中作为有效的底物 。第二步连接反应后 ， 逆转录引物杂交到3端接头 ， 开始启动RT-PCR 扩增（一般是12个循环） 。由于小且片段大小可预测（120bp 接头序列加上20-30bp miRNA插入片段） ， 文库或多个barcode混合样本通常一起进行切胶回收 。由于存在接头二聚体以及非miRNA的连接（tRNA和snoRNA） ， 切胶回收非常重要 。这种文库制备方法导致文库的测序具有方向性 ， 总是从原始RNA的5端到3端 。Ion Torrent 的miRNA测序原则也是相似的 。Ion Torrent利用两种不同的接头连接至miRNA 3端和5端 ， 随后进行RT-PCR 。一般 ， 文库构建步骤可以将任何RNA材料构建成有方向性的RNA-seq文库 。


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