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引物探针问题 怎样消除引物二聚体


引物探针问题 怎样消除引物二聚体

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实时定量PCR分析的部分实施需要进行优化 ， 确保所有反应参数设置准确 ， 从而获得准确的结果 。荧光定量PCR常见的难点包括引物、探针、反应抑制和软件分析 。今天 ， 小姐姐分享她在引物和探针方面的经验 。
实时定量PCR几乎是现代分子生物学中最重要、应用最广泛的核酸定量检测技术 。成功的定量PCR实验离不开准确的实验设计和操作流程 。
引物二聚体引物二聚体的形成是最常见的问题之一 。当引物对之间的一些序列具有同源性时 ， 可以形成引物二聚体 。如果引物在聚合酶链反应过程中退火形成二聚体 ， Taq DNA聚合酶可以延伸二聚体形成比原始引物更长的产物 ， 这可能导致循环过程中更容易出现退火错误 。
问:引物二聚会引起哪些问题？
引物二聚体对反应的影响很大程度上取决于反应中使用的化学物质 。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不大 ， 这是因为探针退火和断裂的现象很少发生在引物二聚体区域 。此时 ， 引物的竞争是需要考虑的主要问题 。基于双链DNA结合染料的反应受引物二聚体的影响很大 。由于染料的结合方式是非特异性的 ， 因此会导致反应过程信息资源网络中监测到的荧光信号增强 。这可以相应地改变Ct值 ， 使结果偏离 。
问:如何确定是否存在引物二聚体？
凝胶电泳是显示引物二聚体的一种很好的方法 。引物二聚体在凝胶底部形成扩散带 ， 通常低于100 bp 。单纯凝胶电泳的缺点是灵敏度最低只有纳克级 ， 所以可能得不到结果 。
熔解曲线也是显示引物二聚体的一种方法 。如果扩增具有优异的特异性 ， 实时荧光定量PCR平板上每个反应孔的解离曲线将具有狭窄的单峰 。引物二聚体的荧光强度低 ， 显示出宽的“波形” ， 表明它在约70℃熔化(见图1) 。

问:如何设计和优化实验以避免引物二聚体？
最好在引物设计阶段采取简单的预防措施 ， 避免从一开始就形成二聚体 。如果出现引物二聚体 ， 有很多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体 。
1.第一步是优化热循环条件 ， 主要是提高退火温度 。大多数情况下 ， 两步循环(从95°C变性步骤直接到60°C退火和延伸步骤)有利于强扩增 ， 因此引物设计中成功设定的退火温度为60°C 。
2.它可以降低引物浓度 ， 甚至有助于使用不同比例的正向引物和反向引物 。大多数情况下 ， 每个引物的理想最终浓度为200~600 nM ， 但必要时可降至60 nM 。
3.镁的最佳浓度一般为3 mM左右 ， 超过这个浓度 ， 引物二聚体容易形成 。
4.如果尚未评估引物形成二聚体的趋势 ， 则应进行补充和重新设计(如有必要) 。一般最好用热启动DNA聚合酶 ， 在冰上进行反应 。
5.理论上 ， 对于同一目标 ， 应该同时检测多个引物组 。事实上 ， 这可以节省很多时间 ， 因为如果这些引物中的一个可以立即工作 ， 则可以减少优化过程中花费的时间 。
引物和探针的储存引物和探针储存不当会导致特异性的退化和丧失 ， 进而影响反应信息资源网络的效率 。影响引物和探针稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否长时间暴露、储存引物和探针的浓度以及储存液的成分 。
问:如何长期保持引物和探针的稳定性？
保持引物和探针的稳定性有四个关键点 。冻干引物在储存时间和温度上具有更好的灵活性 。一旦引物重新溶解 ， 应在-20℃下储存 ， 如果储存超过一年 ， 应监测其功能是否下降 。对于标记的引物和探针 ， 应采取措施避免标记物暴露(例如 ， 使用不透明的试管并将其置于黑暗中) ， 以延长其使用寿命 。
引物浓度也会影响其稳定性 。建议引物贮存浓度不低于10m；；事实上 ， 在大多数情况下 ， 100 M引物浓度更容易操作 。引物和探针也应分开储存 ， 以减少冷冻和解冻时间 ， 特别是标记的引物和探针 。最后 ， TE缓冲液可以形成比水更稳定的环境 。此外 ， 含有0.1 mM EDTA(标准TE中1 mM EDTA)的TE缓冲液是理想的溶液 ， 因为某些PCR反应可能对EDTA有一定的残留敏感性 。


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