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怎样理解人全外显子测序的Duplication问题( 二 )


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■网友
如果是paired-end测序，duplication就要去掉（文库两端坐标完全一致，如果不是PCR duplication或是测序时出现测序芯片上一簇DNA的信号错误，『恰好就是由于测序深度较深碰巧产生了坐标一样的文库』这种情况出现的概率是非常低的，可以大概用文库长度分布算一下概率，而且这种reads少到就算都去掉也对结果几乎没有任何影响）；如果是single-end测序，则无法区分坐标相同的reads是duplication还是真实的多个文库片段的测序结果，一般是不去duplication的。

去duplication可并不主要因为『多出来的分子被重复测到并不能提供太多有用的生物信息』，是因为他们产生了严重的bias，是要必须去掉的。如s Kaelthas所说，如果是PCR duplication，会测到很多很多相同的read pairs干扰深度和allele丰度的判断。如果恰巧这些duplication覆盖到变异区域，可能对call杂合SNP产生严重影响，也会对相关区域的CNV判断产生影响。当然外显子测序一般不涉及更复杂的structural variation，否则造成假的break points什么的也是很烦的。

另外一种除了PCR duplication以外还会出现的状况是（hiseq早期较多），在二代测序里，测序文库里并不存在严重的duplication，但是上机测序时，芯片上的桥式复制过程中产生了信号的散乱，也就是本来不断复制的应该被识别为一个信号的一簇DNA，被识别成了无数簇。导致了在不存在那么多文库DNA的分子的情况下测出了好多坐标一样的read pairs。但是由于信号错误，这些read pairs里含有大量假的SNP，就对后面的分析产生了比较大的影响。比如我自己处理过一个trio的数据，最开始hiseq还不成熟的时候，duplication rate有15~20%，不搭理duplication的话call出的SNP数量要高于正常人300M左右的SNP数，而且孩子的基因组中somatic SNP的数量过高（即无法由父母双方基因型排列组合出来的只能认为是『原发突变』出来的SNP）。很显然，这里面有很多false positive。但是去掉duplication以后就恢复到了正常水平。

■网友
目前来说是合理的：1. Duplication对SNP calling的结果有没有影响？这个有文章说对是否检出影响不大，然而从原理上而言肯定是有影响的。以GATK的UnifiedGenotyper为例（正常人一般用HaplotypeCaller，只是UG原理简单，举个栗子而已），一个SNP的检出是用贝叶斯法计算该点基因型的可能性，而且第一位超过第二位基因型一定倍数才会被检出。于是一个点10x深度，9个A和1个G，这个点很可能还是会被判定为A:A。但是如果这个G有PCR duplication，变成了9个A对5个G，这个点就会被误判成A:G。另外还有一些奇奇怪怪的要求准确获得Allele Frequency的测序，比如ctDNA，这种情况下duplication的影响就更大了。2. 会不会误杀两段在基因组上就是完全一样的序列？肯定会，所以现在要推三代测序来抓捕这些漏网之鱼呀。不过做二代的也不用担心，因为Duplication的去除要求一个序列双端都完全一致，这种几率实在太低了，一般你没区分出来基因组上很可能也没测出来。
■网友
通常来讲，dup是需要去掉的，否则会影响信息分析，当然dup这个东西不可能完全避免，这是测序原理决定的。
我们通常认为片段化是非常随机的，这样的话，dup就来自pcr和测序本身。即使考虑到出现完全相同的片段，我们同样会有合适的数据量来保证这个片段会被其他reads测到过，并且深度足够，影响也是很低的。所以，一个理想的文库和分析，都要结合样本状态、建库起始量、建库方法、测序仪本身和数据量等各个方面来决定。
现在很多分析是三代二代结合分析，三代的大读长确实优势太明显了，但也有错误率问题，所以会用二代去补足。


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