抗性基因插入失活的筛选原理蓝白斑筛选原理及步骤 _蓝白斑筛选原理

文章插图
本篇文章给大家谈谈蓝白斑筛选原理,以及蓝白斑筛选原理及步骤对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站！
内容导航：

抗性基因插入失活的筛选原理
简述α互补和蓝白斑筛选的原理
组成型突变株的筛选原理和方法
重组体和空载体的颜色分别是什么
使用PGEX-4T-1载体，接入目的基因，大虾帮帮忙，选择什么酶切位点和如何筛选重组的载体？
筛选阳性克隆的方法和原理? 我需要至少两种方法和原理,两种.

Q1：抗性基因插入失活的筛选原理
应该是标记基因插入失活筛选吧。
【抗性基因插入失活的筛选原理蓝白斑筛选原理及步骤】最常见的就是蓝白试验了。载体中带有β-gal这个酶的编码序列。而这个编码序列之间正好有很多的酶切位点。如果培养带有没有插入目的基因载体的细胞，这个克隆就会在培养盘上形成蓝色的斑点（降解培养板介质中的底物）。如果载体被插入了外源序列，这个酶的编码区就被破坏了，无法再形成有功能的酶，形成的克隆就是白色的。
挑取白色克隆，就是挑取了有插入的载体了。
Q2：简述α互补和蓝白斑筛选的原理
载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体pGEMZ的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml 。IPTG和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lac Z′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
Q3：组成型突变株的筛选原理和方法
组成型突变株在一定的条件下是致死的，可以通过这个特性来进行筛选。
Q4：重组体和空载体的颜色分别是什么
白色和蓝色。蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。白色菌落为DNA重组子，蓝色菌落为空载体。
Q5：使用PGEX-4T-1载体，接入目的基因，大虾帮帮忙，选择什么酶切位点和如何筛选重组的载体？
蓝白斑筛选不需要基因插入LAC-Z处，你也插不进去，在克隆位点（各种内切酶的位点）插入就可以达到筛选的目的了，你仔细看一下蓝白斑筛选的原理就知道了。
我手头上只有pGEX3和5的载体的资料，但是估计跟4是差不多的。GST区域在那些克隆位点的上游。不知道你说的鉴定是什么意思？是用GST上的引物进行PCR鉴定吗？如果是这样的话，是可以进行鉴定的。不过建议你PCR鉴定完之后再进行酶切鉴定，PCR鉴定存在一定的假阳性率