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质粒构建以及需要注意的事项 质粒构建


质粒构建以及需要注意的事项 质粒构建

文章插图
质粒构建(质粒构建及注意事项)
1.向量构造
载体构建:载体构建是分子生物学研究中常用的方法之一 。主要包括对现有载体多克隆位点(MCS)的改造和对现有载体启动子、增强子、筛选标记等功能性信息资源网元的改造 。为了将DNA分子运送到受体细胞，我们必须找到一种载体，它可以在装载外源DNA片段后进入细胞并进行复制 。理想的载体是质粒 。在基因工程中，经常使用人工构建的质粒作为载体 。载体的构建是构建含有外源DNA的质粒 。
特点:外源DNA片段插入质粒后，仍能自我复制 。
2.多克隆位点
多克隆位点(MCS)指含有几个(最多20个)限制性位点短DNA序列 。又称多接头，是基因工程中常用的载体质粒的标准配置序列 。MCS含有多个单一的限制性位点，是外源DNA插入位点的信息资源网络 。每个限制性位点通常是唯一的，也就是说，它们在特定的载体质粒中只出现一次 。不同酶的限制性位点可能重叠 。单一限制性位点是只能被一种特定酶识别和消化的位点 。多克隆位点通常是位于质粒上的序列，其包含许多限制性位点，但是这些限制性位点中的每一个都被一种酶识别和消化 。

3.质粒构建
(1)质粒构建的原理
质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术 。其原理取决于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用 。在适当切割和修饰目标基因和载体DNA后，将它们连接在一起，然后导入宿主细胞，以实现目标基因在宿主细胞中的正确表达 。
(2)质粒的构建方式
有许多方法来构建质粒，例如常规的T4连接酶 。以下是如何用T4连接酶构建质粒 。T4连接酶可用于平端或粘端连接，但一般推荐使用粘端 。
(信息资源网3)质粒载体的制备
质粒可以通过单或双酶切制备，通常推荐双酶切 。其实目的只有一个，把向量的结尾做得尽可能具体，防止自连 。
4.当一般靶基因用于克隆和表达时，限制性位点的选择应考虑:
(1)质粒上两个酶切位点之间的距离不能小于或过小(> 10bp)，否则会影响限制性内切酶对酶切位点的识别，不利于空载体的双重限制 。
(2)一般情况下，当目的基因用于克隆和表达时，限制性位点的选择应考虑到目的基因片段不含所选的限制性位点(否则，当鉴定出阳性重组体进行双重限制时，目的基因将被切断) 。
【质粒构建以及需要注意的事项 质粒构建】(3)后续实验中使用的所有载体(真核生物、原核生物、酵母和昆虫)都尽可能含有所选的限制性位点 。并确保载体上的插入方向是正确的(定向克隆) 。(否则，当为了表达而改变载体时，应该重新设计引物以引入新的限制性位点) 。
(4)尽量选择常用的酶切位点(常用的酶切位点比较便宜) 。
(5)两个酶切点被至少3个碱基分开 。
(6)两个酶切点最好不要是同一个尾酶(切残基不能互补)，否则效果相当于单酶切 。
(7)最好使用效率高的酶 。
(8)最好使用双酶，用普通缓冲液进行酶切 。


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