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新型冠状病毒|2020年科技抗“疫”研究的七大突破

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2020庚子年 ， 极不平凡的一年 ， 这一年 ， 我们携手走过太多太多的艰难之路 。 回首去岁,我们明白了如何在不确定环境中做到团结一致应对非常之事 ， 又该如何构筑起疫情防控的坚固防线 。
想说再也不见2020庚子年 ， 但是回望这一年里的那些人 ， 重温那些事的时候 ， 心中会想起“英雄的人民 ， 人民的英雄“所作出的惊叹之举 。
【新型冠状病毒|2020年科技抗“疫”研究的七大突破】2020年 ， 新冠肺炎疫情席卷全球 ， 对世界公共卫生构成了严重威胁 。 在这场全民动员抗击疫情的阻击战中 ， 常规防疫手段必不可少 ， 但科学技术——战胜疫情的关键利器——也发挥了重要作用 。 在短时间内 ， 研究人员获得了新型冠状病毒的全基因组序列并分离得到病毒毒株 ， 在不同阶段相继推出多种检测试剂产品 ， 快速筛选出一批有效药物和治疗方案 ， 并将其推荐到临床一线救治患者 。 在科研、临床、防控相互协同 ， 产学研各方紧密配合下 ， 一系列新成果、新办法得到检验推广 ， 为打赢疫情防控这场硬仗注入了强大信心、提供了有力支撑 。 为此 ， 本刊编辑部对2020年抗击新冠肺炎疫情的重大生物研究进行了梳理 。
新型冠状病毒|2020年科技抗“疫”研究的七大突破
文章插图

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首次成功解析ACE2的全长结构
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染人体需要依靠其表面刺突糖蛋白与人体细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合 。 然而 ， ACE2在细胞膜上是以何种形式存在的？与新型冠状病毒的结合又是何种形式？获取ACE2的全长蛋白及其与刺突糖蛋白结合的复合物结构可以很好地解答上述疑问 。 同时 ， 对了解新型冠状病毒感染机制及有针对性的制剂研发有着重大意义 。
2020年2月 ， 西湖大学周强研究团队通过共表达的方法 ， 获得了ACE2与肠道内的一个氨基酸转运蛋白B0AT1优质稳定的复合物 。 利用冷冻电镜技术首次成功解析了ACE2的全长结构 ， 分辨率达到0.29纳米 。 此外 ， 该研究团队借助冷冻电镜技术解析了新型冠状病毒识别ACE2至关重要的胞外结构域结构 ， 分辨率达到0.27纳米 。 通过分析ACE2的全长蛋白结构 ， 该研究团队发现ACE2以二聚体形式存在于细胞膜上 ， 兼具开放和关闭两种构象变化 ， 但两种构象均含有与冠状病毒相互识别的界面 。
该研究为进一步解析全长ACE2和新型冠状病毒刺突糖蛋白复合物的三维结构奠定了基础 ， 为深入理解新型冠状病毒感染细胞过程提供了结构基础 。
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首次证实恒河猴感染模型中存在记忆性免疫保护
RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）是冠状病毒复制、转录的核心组成部分 ， 可催化病毒RNA的合成 ， 在新型冠状病毒的复制和转录周期中发挥重要的作用 。 RdRp是抗病毒抑制剂如瑞德西韦（Remdesivir）的主要靶标 。
2020年5月 ， 中国科学院上海药物所的研究团队分别获得分辨率为0.25纳米的RdRp-RNA-瑞德西韦复合物冷冻电镜三维空间结构、分辨率为0.28纳米的RdRp（未结合RNA和药物）的冷冻电镜三维空间结构 。 冷冻电镜三维空间结构显示 ， RdRp-RNA-瑞德西韦复合物与RdRp的整体结构类似 ， 呈现指掌-拇指形式的RdRp结构域与RNA模板的11个碱基结合 ， RdRp中共有29个残基直接参与RNA的结合 。 瑞德西韦单磷酸（RMP）位于RNA引物链的3'端 ， 在RNA模板的+1位置共价结合到引物链中 。 虽然在RdRp-RNA-瑞德西韦复合物的装配中富含RMPs ， 但仅有1个单独的RMP嵌入到引物链中终止RNA链的延长 ， 进而抑制RdRp的活性 。 该研究阐述了RdRp结合RNA的模式以及瑞德西韦抑制RNA延伸的机制 ， 为抗病毒治疗药物研发提供了理论机制和结构基础 。
3
首次重建新型冠状病毒
因冠状病毒RNA基因组大小和稳定性等问题 ， 研究人员很难在大肠杆菌中克隆病毒基因 。 目前 ， 生物学研究领域需要建立RNA病毒反向遗传学平台 ， 进而加快解密病毒的步伐 。
2020年5月 ， 瑞士伯尔尼大学的研究团队基于病毒分离物、病毒DNA、临床样品和合成DNA生成病毒亚基因组片段 ， 使用转化相关重组（TAR）克隆在酵母中进一步组装 ， 通过T7-RNA聚合酶产生感染性RNA ， 最终形成有活性的RNA病毒 。
首先 ， 研究人员在体外合成了携带绿色荧光蛋白的小鼠肝炎病毒（MHV-GFP）序列 ， 并合成相应病毒 。 病毒活性检测结果显示 ， 合成病毒的感染及复制活性与模板病毒相似 。 随后 ， 研究人员通过同样的方法在体外获得重组中东呼吸综合征冠状病毒（rMERS-CoV）和携带绿色荧光蛋白的中东呼吸综合征冠状病毒（rMERS-CoV-GFP） 。 虽然病毒检测结果显示rMERS-CoV及rMERS-CoV-GFP复制活性相对原始病毒活性有所降低 ， 但此方法仍适用于冠状病毒基因组的合成 。
接下来 ， 研究人员以相似的方式克隆了新型冠状病毒全基因组 ， 合成了重组新型冠状病毒（rSARS-CoV-2）和带有绿色荧光蛋白的新型冠状病毒（rSARS-CoV-2-GFP） ， 其复制活性与原始病毒活性相似 。
以上结果表明 ， 利用反向遗传学平台可以在短时间内合成病毒基因组片段并重新组装成相应病毒 。
相比大肠杆菌的克隆方法 ， 该平台为RNA病毒基因组的合成节省了大量的时间 ， 在无须获得临床样本的前提下即可获得有活性的病毒 。
4
首次证实恒河猴感染模型中存在记忆性免疫保护效应
目前 ， 新型冠状病毒感染是否会诱导机体出现保护性免疫效应尚无研究 。 了解针对新型冠状病毒的保护性免疫效应为抗病毒疫苗研发及公共卫生策略的导向起到一定的指引作用 。
2020年5月 ， 美国哈佛大学医学院的研究团队在同一时间发表两篇关于新型冠状病毒感染恒河猴后机体出现保护性免疫效应的研究论文 。 这两篇研究论文深入探讨了在新型冠状病毒感染的恒河猴模型中自然免疫以及DNA疫苗引起的主动免疫机制 。
在第一项研究中 ， 研究人员首先建立了新型冠状病毒感染的恒河猴模型 ， 然后在9只恒河猴感染模型中注射不同剂量的病毒并将其分为3组 。 在恒河猴感染新型冠状病毒的第35天 ， 这9只恒河猴均出现了特异性抗体免疫反应和细胞免疫反应 。 其中 ， 高剂量病毒注射组内的细胞免疫反应更为强烈 。 在初次病毒被完全清除后 ， 研究人员用与第一次注射剂量相同的病毒再次感染这9只恒河猴 。 结果显示 ， 5只恒河猴体内已经出现完全免疫反应 ， 4只恒河猴体内的病毒载量在检测阈值以下 。 该研究表明 ， 免疫过的恒河猴表现出了免疫记忆效应 ， 可以为再次感染提供免疫保护功效 。
在第二项研究中 ， 研究人员开发了一系列表达不同形式的新型冠状病毒刺突糖蛋白的DNA候选疫苗 ， 并在35只新型冠状病毒感染的恒河猴模型中对其进行了评估 。 结果显示 ， 在接种疫苗的恒河猴体内检测到了体液和细胞免疫反应 。 其中：新型冠状病毒感染的恒河猴体内出现的中和抗体与恢复期患者体内的中和抗体效价相当；编码全长刺突糖蛋白的疫苗使支气管肺泡灌洗液和鼻黏膜中的病毒载量显著降低 。 该研究表明 ， 开发的DNA疫苗在新型冠状病毒感染的恒河猴模型可以实现对机体的保护效果 。
以上研究证实 ， 新型冠状病毒感染的恒河猴模型可以诱导自然免疫反应 ， 形成记忆性保护效应 。 此外 ， DNA疫苗也能为新型冠状病毒感染的恒河猴提供免疫保护效应 ， 有望成为针对新型冠状病毒的候选疫苗 。
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首次在恒河猴体内证实抗体药物潜力
应用新冠肺炎患者恢复期的血浆以及中和单抗治疗重症患者在免疫治疗领域备受关注 。 2020年5月 ， 中国科学院微生物研究所严景华研究团队及合作团队首次在恒河猴模型中证实 ， 从新冠肺炎康复患者体内得到的人源单克隆中和抗体CB6可以有效治疗和预防新型冠状病毒的感染 。 研究人员从新冠肺炎康复患者体内共得到两株能够特异识别新型冠状病毒RBD的抗体 ， 分别为CA1和CB6 。 体外抗病毒检测结果显示 ， CA1和CB6在转染有刺突糖蛋白的人胚胎肾细胞293T（HEK293T）中表现出良好的中和活性 。 其中 ， CB6的中和活性最佳 。 感染新型冠状病毒的恒河猴体内检测结果显示 ， 注射有CB6的恒河猴治疗组在病毒感染后的第一天即可检测到体内的病毒载量开始下降 ， 在病毒感染后的第四天 ， 恒河猴体内的病毒载量急剧下降 。 提前注射有CB6的恒河猴预防组在病毒感染后的第四天 ， 其体内的病毒载量已下降至很低的数值 。 肺部病理检测显示 ， 恒河猴治疗组和预防组内注射的CB6可以有效减少其体内肺部的损伤 。 研究人员介绍 ， CB6是一款阻断及治疗病毒感染的强效候选药物 ， 期待在临床试验中看到它的预防和治疗潜力 。
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最大规模形式解析新型冠状病毒分子结构
尽管有关新型冠状病毒结构蛋白的研究取得了一定进展 ， 但是详细的病毒结构仍有待揭示 。 2020年9月 ， 清华大学生命科学学院李赛团队和浙江大学医学院附属第一医院国家传染病临床研究中心李兰娟院士团队合作 ， 完整地揭露了新型冠状病毒的结构 。 研究人员通过冷冻电子断层扫描和子断层扫描图平均化技术对多种病毒颗粒进行了成像分析 ， 揭示新型冠状病毒的完整结构并阐明病毒如何在直径80纳米的内腔中组装长度为30 kb的长链RNA 。
研究人员借助冷冻电镜技术解析新型冠状病毒的完整结构：从所选的病毒颗粒中鉴定出5 000多个刺突糖蛋白 ， 大部分为融合前构象；在病毒内腔内鉴定了多个核糖体核蛋白（RNPs） ， 平均每个病毒颗粒约含有30多个RNPs；新型冠状病毒的受体结合域（RBD）的分辨率在0.87纳米到1.09纳米之间 ， 其中RBD向下的构象占比多于50% 。 研究人员使用质谱法（MS）分析了天然刺突糖蛋白的22个N-糖基化位点的多糖组分 。 相比于重组刺突糖蛋白的糖基化程度 ， 天然的融合前刺突糖蛋白的糖基化程度要更加复杂 。 此外 ， 天然的融合前刺突糖蛋白的构象稳定性较差 ， 且暴露的表位比重组刺突糖蛋白更为复杂 。
研究人员根据RNPs的解析结构 ， 揭示了RNPs的结构模型 。 从二维层面来看 ， RNPs可分为由膜紧密包装的RNPs以及由六边形和三角形包装的RNPs 。 从三维层面来看 ， RNPs可分为具有六面体结构的近膜RNPs以及具有四面体结构的无膜RNPs 。 相邻的具有六面体结构的RNPs和具有四面体结构的RNPs的间距相同 ， 部分四面体结构可以再次组装成六面体结构 。 此外 ， 研究人员指出 ， RNPs参与新型冠状病毒的组装 ， 并有利于提高病毒对物理环境的抵抗力 。
总之 ， 该研究以最大规模形式解析了新型冠状病毒的完整结构 ， 从分子层面上阐述了融合前和融合后刺突糖蛋白结构、RNPs结构以及它们装配成成熟病毒的机制 。
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首次开发出稳定性最高的刺突糖蛋白
新型冠状病毒属于β冠状病毒家族 ， 与其他冠状病毒相似 ， 新型冠状病毒表面刺突糖蛋白与宿主受体ACE2结合 ， 介导病毒与靶细胞融合 。 刺突糖蛋白为三聚体 ， 具有融合前和融合后两个不同的结构状态 。 免疫系统识别病毒融合前状态对建立有效的免疫反应至关重要 。
由于大多数病毒表面抗原蛋白具有不稳定性 ， 所以很难开发出有效的疫苗 。 冠状病毒的刺突糖蛋白是免疫系统的主要靶标 ， 是疫苗和抗体药物研发的关键靶点 。 低温冷冻电子显微镜研究已表明 ， 严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-1）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的刺突糖蛋白RBD结构域和N末端结构域（NTD）都具有一定的灵活性 ， 两者构象均处于封闭和开放形式之间 。 在闭合构象中 ， RBD反式结合到由相邻单体的NTD和RBD形成的“口袋”（pocket）中 ， 其受体结合位点被封闭 。 在开放构象中 ， RBD指向上方 ， 受体结合位点呈开放状态 。 新型冠状病毒刺突糖蛋白具有多种构象 ， 其RBD也保持闭合和开放两种状态 ， 具有与之前冠状病毒类似的构象动力学 。 研究人员提出 ， 这种构象动力学与受体结合活性以及随后的融合活性有关 。 受体或抗体与RBD开放构象的结合似乎刺激了刺突糖蛋白向融合后状态的转化 。 此外 ， RBD构象动力学可通过蛋白酶消化来调节 ， 其中刺突糖蛋白被切割成S1和S2亚基 。 这似乎也刺激了刺突糖蛋白向融合后状态的转变 。
2020年10月 ， 英国剑桥医学研究理事会分子生物学实验室结构研究部的熊晓犁等研究人员基于对刺突糖蛋白融合机制的理解 ， 开发出了具有热稳定性的刺突糖蛋白三聚体 。 研究人员试图通过二硫键以封闭形式捕获刺突糖蛋白 ， 从而将刺突糖蛋白稳定在预融合状态 。 研究人员设计了两对能够使刺突糖蛋白的RBD与S2亚基发生交联的二硫键 。 其中 ， 一对二硫键可以使刺突糖蛋白的RBD与S2亚基完全交联 。 冷冻电镜数据分析显示 ， 发生交联的刺突糖蛋白颗粒呈现闭合和锁定两种形式 。 锁定构象结构为刺突糖蛋白融合肽附近由833～855氨基酸残基形成的一种特殊折叠构型 ， 位于RBD的下方 。 研究人员推测 ， 锁定构象结构可能是新型冠状病毒刺突糖蛋白的一个中间状态 。 在热稳定性实验中 ， 研究人员进一步发现通过二硫键交联后得到的闭合型刺突糖蛋白可在4 ℃长期保存 ， 即便在60 ℃加热条件下 ， 刺突糖蛋白依然维持其原有结构与抗原性 。
总之 ， 该研究中获得的具有热稳定性的刺突糖蛋白可作为目前稳定性最高的三聚体抗原 ， 为建立稳定的免疫应答反应提供了重要的前期基础 。


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