克隆猴|与猴为伴九年，科学家成功培育出世界首例体细胞克隆猴
出品："格致论道讲坛"公众号（ID：SELFtalks）
以下内容为中国科学院神经科学研究所研究员孙强演讲实录：
大家好 ， 我是来自中科院神经所的孙强 ， 我今天跟大家分享的是我在科研过程中的一些故事 。 我的题目叫与猴为伴的这些年 。
在讲猴子之前 ， 大家先看一下这些熟悉的动物 。 这些动物 ， 我们给它统一命名叫实验动物 ， 比如大家都知道的小白鼠 。 那为什么要做实验动物呢？
举一个简单的例子 ， 我们生病了都会吃药 ， 然而很多药不一定有效 ， 还可能存在安全性的问题、毒性的问题 ， 因此不能用人做实验 ， 要先用实验动物去做筛选工作 。 通过在它们身上做实验 ， 最后筛选出可以给人用的药 。
同时 ， 我们需要把实验动物做得标准化 。 就像高考 ， 不能一百个考生一百张考卷 ， 我们一定要用同样的“考卷”来考 。 所以我们希望把实验动物做得标准化 ， 而且还需要这个“考题”有足够的“难度” ， 能够真正起到考核的作用 ， 所以我们要对动物的基因进行操作 。
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大家看到这张图上 ， 有小鼠、有大鼠、有羊、有兔子、有狗 ， 还有牛 。 如果大家了解一点进化论 ， 就知道这些动物的进化关系跟人类相对远一些 ， 我们更希望用什么动物呢？用跟我们进化关系更近的 ， 比如猴子去做实验 。
为什么列了这六种动物呢？因为博士毕业以前 ， 这几种动物我都接触过 。 那我怎么就跟猴子结缘了呢？我是做辅助生殖和生殖技术的 ， 多数人博士毕业以后 ， 都会选择出国留学做博士后 ， 然后发两篇好的paper ， 再去选一个好的工作 。 但是有一件事改变了我的选择 。
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大家可能不认识这只猴子 ， 它叫安迪 。 2001年的时候 ， 它出生了 ， 这是全球第一个转基因猴 ， 它的诞生意味着人类可以对猴子进行遗传操纵了 。 也就是说 ， 我们可以把猴子做得比较标准化 ， 成为符合我们要求的特定“考生“的一个“考卷” ， 比如对特定疾病 ， 我们可以做特定的模型 。
这个技术出现后 ， 当时我想 ， 中国（当时）每年出口的猴子量大概3万头 ， 是全球灵长类动物最大的出口国 ， 说不定做猴子是个机会 。 所以在2004年 ， 博士毕业前 ， 我就选择了这样一个工作——去做猴子（模式猴） 。
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在讲做猴子之前 ， 先给大家看这张图 。 这只猴子 ， 它要比安迪年龄大 ， 1984年出生的 ， 它叫皮特瑞 ， 是全球第一个试管猴 ， 通过试管技术做出的猴 。 当时看到这个信息 ， 心里觉得很不爽 ， 为什么？因为美国人在1983年就做了这只猴（1983年开始做 ， 1984年出生） ， 而我决定做猴子的时候已经是2004年了 ， 20年过去了 ， 我们国家还没有试管猴的技术 ， 我想 ， 有这么难吗？所以我在2005年7月博士毕业以后 ， 没有选择出国 ， 选择了上山 。
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大家看到图中的这座山 ， 在云南省的西双版纳州 ， 下边这条河叫澜沧江 ， 右边还有一个索道 ， 索道就是上山的通路 。 我在山上经常一待就是一周 ， 就这样 ， 我在山上待了4年 ， 一直待到2008年 。
这是一个973国家重点研发项目 ， 我接手的时候 ， 这个项目已经执行了一半 。 因为2001年转基因猴技术体系已经建立了 ， 所以项目的目标是希望做出转基因猴 。 我是半途去的 ， 所以给自己定的目标是至少要做出试管猴 ， 当然了 ， 如果能做出转基因猴更好 。
我记得非常清楚 ， 在2007年立春的2月4号这天 ， 我们就做出了中国第一只试管猴 ， 之后又做了十几只猴子 ， 但是很遗憾 ， 没有一只是转基因阳性的 。 这个项目结束以后 ， 由于没有资金的支持 ， 我就从山上撤回来了 。
回来以后 ， 在上海待了半年多 。 猴子（转基因猴）没有做成功 ， 也没有发出好的文章 ， 也不是海归 ， 工作的提升空间就变小了 ， 所以犹豫了一段时间 ， 甚至开始怀疑当时的选择是不是错了 。
但很幸运 ， 一个机会出现了 。 中国科学院神经所的蒲慕明先生找到我 ， 让我继续做猴子 。 我很开心 ， 因为我已经跟猴子分开那么久了 。 蒲先生说在上海重新开始 ， 我说不要在上海重新开始 ， 那太慢了 ， 重新建一个猴子设施需要很长时间 ， 所以我又选择了进岛 。
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【克隆猴|与猴为伴九年，科学家成功培育出世界首例体细胞克隆猴】这是苏州的太湖 ， 大家都知道太湖方圆有800里 ， 里边有个西山岛 ， 上面有一个很大的猴场 ， 有1万多只猴子 ， 所以我就又到岛上去陪猴子了 。
去太湖跟去西双版纳不同 。 当时在西双版纳 ， 我带了几个学生去 ， 还有合作方配合 。 但是太湖 ， 因为我想把它做得更好 ， 就决定自己管所有的事 ， 要自己负责所有的设施 。
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首先 ， 要在岛上租房 。 我们先租了一个类似北京四合院的地方（左图） ， 大概有13个房间 ， 然后把我的人带过去 ， 在这里安家 。 左图中穿黄衣服的是我的管家 ， 穿白衣服的是在西双版纳的时候就跟我一起做试管猴的兽医；右图是当时接近废弃的一个实验室 ， 我们也把它租了下来 。 开始付不起租金 ， 所以就租了大概100多平的地方 。
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要做转基因猴 ， 首先要把猴子养好 。 为什么我们选这里？因为这里有很好的猴子设施 。 大家看左边的图 ， 有3米的阳光可以射进猴房 。 因为猴子是社群性动物 ， 它需要阳光照射 ， 才能保证维生素的吸收 ， 它也需要大面积的空间 ， 所以在接近30平米的空间里 ， 我们一般养12到15只猴子 。
既要猴子要养好 ， 还要完成实验 ， 我们要做的是辅助生殖实验 。 猴子的进化跟人很近 ， 比如在生殖内分泌方面 ， 猴子跟人是一样的 。 特别是母猴 ， 是有月经周期的 ， 月经周期平均28天 ， 有卵泡生长、排卵和黄体期 ， 而且也是单胎生殖 。
我们做辅助生殖实验 ， 是希望拿到更多的卵母细胞 ， 因此就要让猴子超数排卵 。 超数排卵显然不能在黄体期 ， 黄体期给药的话 ， 卵是排不出来的 ， 必须在卵泡生长期 ， 也就是它月经来了以后 ， 开始给它注射激素 ， 然后到要排卵的时候 ， 看见它排卵 ， 再把卵取出来 。
那么就有一个问题 ， 我需要知道每只猴子的月经周期 ， 如果不知道的话 ， 就没办法得到卵 。 猴子不会告诉我们什么时候来月经 ， 也不能去蒙 ， 这就需要去看、去观察 。
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如果把猴子养到这样一个笼子里 ， 我们做事就很舒服了 。 这个笼子有个拉杆 ， 一拉就能把猴子拉过来 ， 这样就看得很容易 。 但是刚才讲了 ， 猴子是社群动物 ， 这样猴子会不满意 ， 它会抑郁 ， 健康状态也下降 。 那怎么办呢？
在西双版纳山上的4年期间 ， 我就思考过这个问题 。 在西双版纳我换了3批猴子 ， 每批大概做半年左右就不行了 ， 厂家很负责地给我换 。 但是我的资金有限 ， 我必须把每个猴子都用好 。 我们知道猴子很聪明 ， 所以我就要求我的兽医要跟它做朋友 。 当然了 ， 不是简单做朋友 ， 而是要跟猴子长时间待在一起 ， 教会它做事 。
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这里有个视频 ， 就是我们怎么看猴子的月经 。 这是2011年来到我这里工作的兽医 ， 叫聂艳红 。 她来的时候还是实习 ， 在这个猴房待了三年以后 ， 她就可以很容易地让这十几只猴子听她的话 。
比如要看猴子的月经 ， 她给猴子一个指令 ， 好多猴子就会停在那里 ， 让她去做这件事 ， 这样就解决了大问题 。 现在我们岛上大概有1000多只猴子 ， 每年看猴子的月经累计要看5万多次 。
我们还要给猴子打针 ， 就是给它注入激素 ， 也要在这里完成 。 不能把它放单笼里 ， 因为它的健康状态会下降 。 另外猴子平时会生病 ， 比如腹泻、肺炎或者咬伤 ， 我们都要处理 ， 熟悉以后其实也很easy 。
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这是我的另一个兽医 。 这只猴子生病了 ， 兽医要去给它打一针 ， 不用去追它 ， 只要给它一些指令 ， 它就停在这里了 。 每次猴子超排 ， 从月经来的第一天开始 ， 一般要打12天 ， 一天打2针 。
就这样 ， 我们养好了猴子 。 动物好是基础 ， 基础好了 ， 我们还要做事 ， 做事得先搭台子 。
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我们租的是废旧设施 ， 留下好多猴笼 ， 为了节约资金 ， 我就继续用旧的猴笼 。 但是有些猴子不老实 ， 比如一些怀孕的猴子 ， 它们有时候会把笼子给拆掉 。 笼子坏掉了 ， 猴子就跑掉了 ， 这是很麻烦的事情 。
如果让厂家来帮忙维修 ， 厂家经常反应很慢 ， 要等两三个月 。 所以后来我就招了一个会做电焊的小伙子 ， 给他买了电焊机 ， 一旦有问题他就可以马上处理 。 不但如此 ， 我们的实验室也是自己装修粉刷的 ， 车篷也是我们自己修的 ， 大家都以我们的平台为家 ， 自己弄 。
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平台搭建好了 ， 就要做出真正的模型 ， 给药物研发出“考卷” 。 举一个例子 ， 实验期间我们做了这样一个模型：把一个孤独症相关的基因转到猴子里 ， 结果发现部分猴子出现了这种情况：猴子总是绕一个方向这样转来转去 ， 就像图中显示的这样 。
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我们知道患有孤独症的小孩会有刻板行为和社交障碍 ， 猴子也是一样 。 把两个猴子放在一起 ，正常的猴子会很开心 ， 它们会聊聊天或者做个游戏 。 但是把我们这两个转基因猴放在一起 ， 它们互相不理睬 ， 都躲到角落里 。
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这项工作我们2011年就做出来了 ， 经过一系列的行为学表型分析 ， 得到了它的F1代 。 《自然》杂志接受了我们的文章 ， 这项工作也获得了2016年中国的十大科学进展奖 。
我们还做了很多其他动物模型 ， 但是发现了一些问题：用前面的方法做的猴子 ， 由于基因型不一致 ， 不能做复杂操作 。 假设猴子是一张“考卷” ， 我不能在它身上出很复杂的题 ， 比如同时改变好几个基因 ， 改变3个或4个基因 ， 这点做不到 ， 因为在胚胎学上效率低 ， 而且猴子的遗传背景也不一致 。
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如果大家有一点生物学背景的话 ， 就知道小白鼠是可以通过连续20代近交 ， 得到近交系 ， 近交以后遗传背景是一致的 。 小鼠的繁殖周期大概是半年 ， 连续20代也就顶多10年时间 ， 而且这件事在上个世纪初就做完了 。 但猴子的繁殖周期、性成熟时间、传代时间要5年 ， 做20代就要100年 ， 我相信这样做的话 ， 没人能做得成 。
所以 ， 我虽然能出“考卷” ， 但是这个“考卷”并不能真正把我想要的东西“考”出来 ， 也就是说这个“考卷”出得太简单了 ， 不能做成模型 。 那么 ， 有没有办法能做成模型呢？有 ， 就是通过克隆 。
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我给大家介绍一下克隆的过程 。 大家看上面这张图 ， 我们先从红色的猴A取出体细胞 ， 再从蓝色的猴B取出卵母细胞 ， 然后把卵母细胞的核去掉 ， 核是遗传物质 ， 把遗传物质拿掉 ， 把体细胞跟卵母细胞放到一起 ， 然后把它激活 ， 变成一个胚胎 ， 移到橙色的猴C ， 最后生出一只猴子 ， 它就是猴A的克隆 。
1997年第一个克隆哺乳动物的“报道” ， 就是克隆羊多莉 。 那为什么克隆可以解决上述问题？因为通过克隆我可以在体细胞上做遗传操作 ， 细胞可以在体外无限增值 ， 我可以拿到106、107……很多很多的细胞 。
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我们对来自猴A的体细胞进行体外基因编辑 ， 成为单个细胞 ， 拿这个细胞再去克隆的话 ， 生出的猴子就带有这个基因 。
最关键的一点 ， 刚才说了 ， 猴子有一个大问题 ， 就是它的传代时间在5年以上 。 比如我出一张“考卷”想快速“复印”给很多人去用 ， 给药厂做药物筛选 ， 可以用猴子做模型 ， 但是要等五年才能把这猴子“复印”出来 ， 这样的效率 ， 做生物学是等不起的 。
那有没有快速“复印”的办法？我们知道猴子的怀孕期是160天 ， 也就是说160天我能拿到一个带有遗传操纵的克隆猴 。 如果连续做 ， 一年内我就有可能拿到很多这样的克隆猴 ， 而且这些猴子的遗传背景是一致的 ， 都来自这个体细胞的猴A ， 它的基因型也是一致的 。
这样就完全解决了我前面说的那些问题 ， 这个“考卷”是好用的 ， 而且能够快速拿到很多“考卷”去给大家用 。 但是这件事要做成 ， 首先就是要能做克隆猴 ， 做克隆猴有点难 。
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1997年克隆羊多莉诞生后 ， 有二十几种哺乳动物都克隆出来了 ， 大家会想 ， 那猴子有没有人在做？其实2002年就有人做 ， 到2003年的时候 ， 美国匹兹堡大学的杰瑞·沙腾教授也费了很大劲儿在做这件事 。 美国有八大灵长类中心是国家支持的 ， 其中最早的灵长类中心叫俄勒冈灵长类中心 ， 大概有7000多只猴子在那里存着 。 杰瑞·沙腾教授依靠着灵长类中心 ， 曾经一次性做了700多个卵 ， 然后移植到30多个猴子体内 ， 最后都没生 ， 他当时很失望 。
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于是杰瑞·沙腾教授得出一个结论 ， 就是用现有的方法做不出体细胞克隆猴 。 为什么？大家看上图 ， 图B是细胞分裂的时候形成的一个好的纺锤体 。 杰瑞·沙腾教授发现 ， 克隆猴的胚胎在做核移植的时候 ， 会把形成纺锤体的关键蛋白去掉 ， 导致纺锤体不能成形 ， 细胞就不能正常分裂 ， 这样胚胎也不能发育 ， 所以他觉得肯定做不成了 ， 他把相关paper也发到《Science》了 。
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之后 ， 俄勒冈灵长类中心的另一位教授——米塔利波夫 ， 他不服 ， 他觉得这可能是技术问题 ， 要去解决 。 所以他一直坚持在做 ， 发了很多文章 。 2007年的时候 ， 他接受一个杂志的采访 ， 说他已经用了15000枚卵来做这个猴子 。 到2010年的时候 ， 他发了一篇paper ， 就是把克隆胚胎移到10个猴子体内 ， 但是只有1只怀孕 ， 但是怀孕到81天 ， 这个猴子流产了 。
我刚才说了 ， 猴子怀孕期是160天 ， 81天代表什么？代表路程已经走了一半 。 2012年我们启动这个项目时 ， 蒲先生对我说：“米塔利波夫已经把这条路的前一半走完了 ， 我们要把后一半走过去 。 ”但是后一半有点难 ， 最关键的是要能解决猴模式动物构建中的一些问题 。
我们知道小鼠多胎生 ， 卵母细胞资源无限 ， 因为小鼠好养 ， 而且繁殖快 。 那家畜呢？家畜是我们的食物 ， 它的卵巢就是我们吃肉的副产品 ， 所以卵母细胞资源也很丰富 。 但是 ， 我们知道猴子有月经 ， 它不像小鼠繁殖那么快 ， 它的卵母细胞资源有限 ， 所以我们不能去赌 。
米塔利波夫用了15000枚卵都做不出来 ， 15000枚是什么概念呢？2012年项目启动的时候 ， 我们大概有300多只猴子 ， 都是可以超排的 ， 把所有的猴子的所有周期都用上 ， 都拿不到15000枚卵 。 所以我们要一步步地解决问题 。
我们总共用了接近五年时间去解决这些问题 ， 前边都是失败、失败、失败 ， 最大的失败出现在2017年的8月 。 大家可能知道 ， 2017年年底的时候 ， 我们的克隆猴中中、华华诞生了 。 其实在2017年8月的时候 ， 我们就得到了两只克隆猴 ， 一只在140多天的时候生出来 ， 活了三个小时 ， 没有肺呼吸 ， 死掉了；另一只活了30个小时也死掉了 。
那个时候我们的失望达到了极点 ， 就像买彩票 ， 彩票中奖号码是10个 ， 第1个号码到第9个号码都是对的 ， 然后到第10个号码突然错了 。 这种感觉让人很失落 。 当时我们团队只有三个人 ， 就是管细胞的管家、第一作者刘真和我 。 太湖很大 ， 我就带他们到湖边转一转 ， 散散心 。
我跟他们说 ， 我们要从失败中走出来 ， 我们已经有很大的进步了 ， 因为猴子已经到full-term（足月）了 ， 不像米塔利波夫的只是一个流产的组织 ， 我相信我们一定能做出来 。 2017年年底 ， 我们终于成功做出了克隆猴 。
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我必须要介绍一下我们的兽医团队 。 大家知道 ， 人类和猴子在进化上的共同的祖先曾经生活在大草原上 ， 而大草原上有很多猴子的天敌 ， 所以猴子在生产的时候 ， 都选择后半夜 ， 因为这样在进化上会有优势 。 如果它选择白天生产 ， 很可能被敌人、捕食者发现 。
克隆猴也是这样 ， 经常在后半夜生产 ， 而且克隆猴经常会难产 。 那怎么办？猴子快临产的时候 ， 它也不会告诉我们 。 没办法 ， 我们就只能发挥人力——兽医进行监控 。
在猴子临产前的一个月 ， 也就是130天左右的时候 ， 我们把它放到红外摄像机下 ， 让我们的兽医24小时去看是否有临产症状 ， 一旦有临产症状 ， 就打电话给主兽医 ， 给猴子做助产或者剖腹产 。
所以我要求我的兽医电话不能断电 ， 不能静音 ， 还要24小时开机 。 猴子很有脾气 ， 它经常后半夜响 ， 所以兽医经常半夜起来 。 因为经常这样半夜爬起来 ， 所以有一天我们的兽医发了个状态 ， 说半夜的电话铃声像一声惊雷 ， 他怀疑自己得了职业病 。
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但是这份工作是值得的 。 2017年11月27日 ， 我们的第一只克隆猴 ， 中中 ， 在凌晨3点钟剖腹产生出来了 。 12月5日第二只克隆猴 ， 华华 ， 在半夜11点多剖腹产生出来了 。 上面这个照片就是中中和华华 。
这里有个视频 ， 是2018年五月底 ， 克隆猴中中华华半岁的时候拍的 ， 它们刚刚断奶 。 我们把它们跟两只普通的食蟹猴放到一起群养 。
从毛色上看 ， 两个毛色有点泛黄的是克隆猴 。 但从外表很难分清哪个是中中 ， 哪个是华华 ， 我也要根据它们的行为状态来区分 。 大家看视频 ， 中中喜欢做一个动作 ， 就是抱着它的小伙伴 ， 而且它非常喜欢做这个动作 ， 这是它的标志性动作 。
真的很幸运 ， 我们团队经过努力 ， 终于把克隆猴突破了 ， 但我觉得这只是个新起点 ， 我们希望在这个基础上能做更好的模式动物 。
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最后 ， 我要首先感谢蒲先生 ， 当我在西双版纳做猴子做不下去的时候 ， 他给了我一次机会 ， 并且在这九年一直支持我 。 也感谢我团队的核心刘真 ， 他在博士毕业的时候发了《Nature》文章 ， 本可以去找更好的工作 ， 但他继续在我这里坚守 。 还有我的管家蔡毅君 ， 包括刚才我说的得了职业病的兽医 ， 以及我的团队 。
我还要感谢一下我的家人 ， 因为这些年跟猴子在一起的时间 ， 比跟他们在一起的时间都多 。 谢谢大家 。
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