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高分辨率|高分辨率SARS-CoV-2甲基转移酶结构揭示转录后加工分子机制

截止2020年10月4日 ， 全球新冠确诊病例已超过3500万 ， 死亡病例100多万 。 面对严峻的疫情 ， 多国研究者从不同角度开展了关于SARS-CoV-2的基础研究与临床试验 。 大多数研究集中于新冠病毒的结构蛋白与宿主受体、蛋白酶的相互作用 ， 开放相应的抑制剂和中和抗体 ， 对于病毒转录加工方面的认识相对较少 。 近日 ， 美国西北大学Satchell团队利用X射线衍射解析了新冠病毒mRNA甲基转移酶nsp16与nsp10的复合体结构 ， 深度解析了甲基转移酶的催化机理 ， 为新冠病毒抑制剂的开发提供新的策略 ， 相关研究成果发表在国际期刊ScienceSignaling上 ， 题为“High-resolution structures of the SARS-CoV-2 2′-Omethyltransferase reveal strategies for structure-based inhibitor design” 。
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标题
冠状病毒为适应宿主系统 ， 其RNA基因组具有典型的5’帽子和3’尾巴结构 。 病毒基因组能够以第一阅读框orf1和移码变体orf1ab翻译出多聚蛋白 ， 在蛋白酶作用下加工为非结构蛋白质 ， 参与形成复制转录复合体 ， 另一方面又可以自身RNA作为模板合成亚基因组mRNA 。 冠状病毒mRNA合成类似于真核生物 ， 其中关键的蛋白质是非结构蛋白nsp14和nsp16 ， 首先N7甲基转移酶nsp14等病毒蛋白催化GpppN序列鸟嘌呤甲基化形成Cap0结构 ， 接着在2’O甲基转移酶nsp16催化核糖甲基化修饰为Cap1结构 ， 此外 ， nsp10对于nsp14和nsp16与RNA的结合起重要的稳定作用 。 转录后过程对于病毒逃逸宿主免疫至关重要 。
新冠病毒基因组结构
研究者首先表达纯化了新冠病毒nsp10和nsp16蛋白 ， 在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)存在下利用X衍射晶体学技术解析了不同状态下nsp16-nsp10共晶复合物 。 在第一个构象（小晶胞）中 ， nsp16-nsp10形成异源二聚体 ， 甲基供体SAM结合nsp16 ， 锌离子结合nsp10；而在第二种构象（大晶胞）中 ， 两个二聚体形成了四聚体的不对称单元 。 通过结构比对 ， 发现大晶胞与小晶胞除了nsp16 环区差异较大外 ， 结构基本一致 。 利用尺寸排阻色谱法进一步证实了nsp16-nsp10结合比例 。 晶体结构表明nsp16 2'-O甲基转移酶活性中心具有罗斯曼折叠的超二级结构 ， 而nsp10中心则是反平行β折叠结构 ， 同时还具有锌指结构域 ， 能够非特异性结合RNA 。 nsp16/10界面的残基表明氢键、疏水相互作用参与两个蛋白质结合作用 。
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二聚体与四聚体结构
根据反应机理推测 ， nsp16能够催化SAM上的甲基转移到RNA Cap0结构上 ， 生成S-腺苷高半胱氨酸(SAH)和Cap1结构 ， 该反应可以被SAH的类似物SFG抑制 。 为了探究其中的分子机制 ， 分别测定了不同复合体的结构 ， 研究者观察到SAM能够结合到nsp16负电荷裂隙中 ， SAH、SFG与相同的残基作用但是不能进行结构修饰 。
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催化机制
除了甲基供体外 ， nsp16催化还需要满足RNA1位为腺苷酸 ， 因此研究者进一步分析了RNA m7GpppA与nsp16/10的结合机制 ， 发现RNA上的腺苷酸能够与蛋白质的酪氨酸形成芳环堆积 ， 使得RNA与SAM结合区更接近以便甲基转移 。 nsp16上的催化区域(KDKE）对于催化甲基转移SN2反应至关重要 。 同时研究者发现m7GpppA结合于nsp16的高亲和力位点 ， 该区域可变性较大 ， m7 GpppA的结合能够使其从封闭构象转变为开放构象 ， 释放甲基化产物 。 此外研究者还鉴定出nsp16其他RNA结合位点 ， 可能也参与了转录后加工 。
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结合位点分析
为了分析SARS-CoV-2与其他病毒的甲基转移酶差异 ， 研究者又比较了SARS、MERS、SARS-CoV-2的nsp16/10结构 ， 结果表明SARS-CoV和SARS-CoV-2的nsp16/10高度相似 ， 但是在nsp16的环区中 ， SARS构象更为封闭 ， 而新冠病毒的构象较为开放 ， 这些都说明了冠状病毒甲基转移酶受到很强的正选择作用 。
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SARS、MERS、SARS-CoV-2 nsp16结构
该研究首次揭示了新冠病毒nsp16-nsp10复合体结构及其RNA修饰催化机理 ， 为了解病毒的转录后加工提供结构基础 。 鉴于nsp16在冠状病毒中高度保守 ， 且nsp16突变的毒株更容易被免疫系统清除 ， 因此nsp16可能是一个良好的新冠病毒治疗靶点 。 设计小分子靶向nsp16/10界面可能有效阻断RNA甲基转移酶活性 ， 激活干扰素应答信号通路 ， 值得后续深入研究 。
来源：Science
链接：https://stke.sciencemag.org/content/13/651/eabe1202


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